La legendaria guerrera vampira Selene (Kate Beckinsale) se enfrenta a su mayor y más poderoso adversario, al tiempo que descubre un perturbador secreto que cambiará todo por lo que siempre luchó. Quince años han pasado desde que Selene y su amante Michael, híbrido entre humano y licántropo, derrotaran al Vampiro Mayor Marcus en Underworld Evolution. En esos años, la humanidad ha descubierto la existencia tanto del clan de los vampiros como del de los licántropos y se ha lanzado a una lucha encarnizada para erradicar ambas especies. Selene, capturada durante el genocidio, se despierta después de más de una década y se da cuenta de que se encuentra cautiva en un laboratorio herméticamente cerrado en Antigen, una poderosa corporación biotecnológica.
Selene se siente destrozada cuando descubre que Michael está muerto, pero su dolor es eclipsado por el descubrimiento de que mientras se hallaba criogenizada ha dado a luz a la hija de ambos. Mientras busca asilo para ella y su hija, Selene se encuentra con que el mundo en el que su raza se alzara orgullosa ya no existe y que su gente ha sido perseguida hasta el borde de la extinción.
Rechazada por los clanes que aún quedan, Selene se enlista para apoyar a un joven vampiro, David (Theo James), quien se une a ella en su sangrienta venganza contra Antigen, donde oscuras fuerzas conspiran para destruirla tanto a ella como a su hija. Con sus tradicionales enemigos, los licántropos, otra vez en ascenso, incluso Selene parece no tener el poder suficiente para hacer frente a su más poderoso oponente en toda la historia de Underworld: un super licántropo alterado genéticamente
